Применение технологии CRISPR/Cas9 для создания мутаций у сома

Технологии редактирования генома, такие как CRISPR/Cas9, стали настоящей революцией в биологии и генетике. Они открывают новые горизонты для манипуляций с генами, что особенно актуально в аквакультуре, где необходимо решать проблемы перенаселения, сохранения рыбных ресурсов и предотвращения негативного влияния на дикие популяции. Одной из интересных задач является создание рыб без зародышевых клеток, что может значительно упростить процессы разведения и улучшения качества аквакультурных организмов.

Технология CRISPR/Cas9 и её применение

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) в сочетании с Cas9 (CRISPR-associated protein 9) представляет собой механизм, который позволяет целенаправленно вносить изменения в ДНК организмов. Эта технология позволяет создавать мутации, приводящие к потере функции определённых генов, что может быть использовано для получения желаемых фенотипов. В контексте аквакультуры, это открывает возможность создания, например, полосатого сома (Pangasianodon hypophthalmus) с изменённым количеством половых клеток, что может помочь в управлении размножением и предотвращении перенаселения.

Цели и методы исследования

Целью данного исследования было разработать методы нокаута гена dnd1 (тупиковая последовательность 1) у полосатого сома с помощью CRISPR/Cas9. Ген dnd1 играет ключевую роль в развитии половых клеток, и его нокаут может привести к значительному снижению количества первичных половых клеток (ППК) у рыб.

Для оптимизации процесса нокаута были разработаны три одноцепочечные направляющие РНК (sgRNA), нацеленные на последовательности, расположенные выше стартового кодона гена dnd1. В оплодотворённые икринки полосатого сома микроинъецировали комбинацию из двух концентраций каждой sgRNA (100 и 200 нг/мкл) и трёх концентраций Cas9 (100, 250 и 500 нг/мкл).

Результаты и их анализ

Результаты эксперимента показали, что sgRNA/Cas9 могут вызывать инсерционные мутации и снижать количество ППК. Гистологический анализ, проведённый после инъекций, показал, что комбинация sgRNA3, нацеленная на участок выше и ближе к стартовому кодону, в концентрации 200 нг/мл и Cas9 в концентрации 500 нг/мл, продемонстрировала наименьшее количество ППК. Это подтверждает эффективность выбранной стратегии редактирования генома.

Кроме того, были проведены эксперименты по гибридизации in situ с использованием антисмысловых зондов dnd1 и vasa, которые также подтвердили снижение количества ППК. Все комбинации sgRNA/Cas9 снижали экспрессию не только dnd1, но и других генов, таких как cxcr4b, dazl, nanos1, nanos2 и vasa, что указывает на широкое влияние редактирования на генетическую регуляцию в гонадах рыб.

Исследование, проведённое с использованием технологии CRISPR/Cas9, открывает новые перспективы для аквакультуры. Создание полосатого сома с нокаутированным геном dnd1 может стать важным шагом в управлении размножением и сохранении рыбных ресурсов. Эта технология не только помогает решать проблемы перенаселения, но и предотвращает негативные последствия, связанные с попаданием генов от сбежавших с ферм рыб в дикие популяции. Таким образом, CRISPR/Cas9 может стать ключевым инструментом в устойчивом развитии аквакультуры и сохранении биоразнообразия водных экосистем.

Источник: Animal