Глутатион уменьшает вызванное гипоксией повреждение жабр у молоди белого амура за счёт снижения стресса эндоплазматического ретикулума и аутофагии

Глутатион уменьшает вызванное гипоксией повреждение жабр у молоди белого амура (Ctenopharyngodon idellus) за счёт снижения стресса эндоплазматического ретикулума и аутофагии

В условиях интенсивной аквакультуры гипоксия становится серьёзным стресс-фактором, приводящим к структурным и функциональным повреждениям жаберного аппарата рыб. Данное исследование было направлено на изучение защитной роли диетического глутатиона (GSH) против гипоксического повреждения жабр у молоди белого амура и выяснение лежащих в его основе молекулярных механизмов. Шесть экспериментальных рационов с фактическим содержанием GSH 0.00, 145.95, 291.90, 437.85, 583.80 и 729.75 мг/кг скармливали рыбе в течение 70 дней, после чего подвергали 96-часовому гипоксическому стрессу (1 мг O₂/л) в сравнении с нормоксическим контролем (6 мг O₂/л). Результаты показали, что добавление GSH в диапазоне 291.90–437.85 мг/кг достоверно улучшало скорость роста, антиоксидантный статус (повышало активность SOD, GSH-Px, GR, снижало уровни ROS, MDA, PC) и гистологическую структуру жабр, ослабляя патологические изменения, вызванные гипоксией (отслоение и некроз эпителия, искривление ламелл). Механистически GSH подавлял гипоксией-индуцированный апоптоз в жабрах, регулируя экспрессию генов каспаз (caspase-3, -8, -9), Bax, Xiap и Smac. Кроме того, GSH ингибировал все ключевые этапы аутофагии: инициацию и нуклеацию (снижая экспрессию Ulk1 и Beclin1), элонгацию (уменьшая уровень LC3b-II) и деградацию (повышая уровень p62). Параллельно GSH эффективно ослаблял стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР), подавляя активацию всех трёх ветвей ответа на развёрнутые белки (UPR): пути PERK-eIF2α-ATF4, IRE1-XBP1 и ATF6, а также снижая уровни ключевых маркеров (GRP78, CHOP) и компонентов ассоциированного с ЭПР пути деградации (Hrd1, Sel1l). Корреляционный анализ подтвердил взаимосвязь между стрессом ЭПР и активацией аутофагии при гипоксии. На основе регрессионного анализа содержания ROS и PC в жабрах определены оптимальные уровни диетической добавки GSH для смягчения гипоксического стресса у молоди белого амура: 437.10 и 495.00 мг/кг соответственно. Таким образом, глутатион проявляет многогранный протекторный эффект, защищая жабры от гипоксического повреждения через комплексное подавление окислительного стресса, апоптоза, избыточной аутофагии и стресса ЭПР, и может быть рекомендован как эффективная кормовая добавка в аквакультуре для повышения устойчивости рыб к гипоксии.

Индустрия аквакультуры играет критически важную роль в обеспечении продовольственной безопасности, на её долю приходится значительная часть мирового производства водных биоресурсов. Однако её интенсивное развитие, характеризующееся высокой плотностью посадки, часто ведёт к ухудшению качества воды, в том числе к дефициту растворённого кислорода (гипоксии). Гипоксия является мощным стресс-фактором, вызывающим у рыб окислительный стресс, нарушение роста и повышение восприимчивости к заболеваниям. Жабры, как первичный орган газообмена и осморегуляции, непосредственно контактируют с водной средой и особо уязвимы к гипоксическому повреждению, что проявляется в структурных аномалиях, таких как гиперплазия эпителия, искривление ламелл и некроз. Эти повреждения во многом опосредованы избыточным образованием активных форм кислорода (АФК), запускающим каскад патологических процессов: окислительную модификацию липидов и белков, стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР), дисрегуляцию аутофагии и апоптоз.

Глутатион (γ-глутамил-цистеил-глицин, GSH) — важнейший внутриклеточный низкомолекулярный трипептид и неферментативный антиоксидант, играющий ключевую роль в поддержании клеточного редокс-гомеостаза, детоксикации и сигнальных процессах. Предыдущие исследования, включая наши собственные, продемонстрировали, что диетическая добавка GSH улучшает показатели роста, антиоксидантный статус и устойчивость белого амура к токсинам. Также показано, что GSH может allevировать жаберные повреждения, вызванные аммиаком, у карпа. Однако потенциальный защитный эффект GSH конкретно против гипоксического повреждения жабр и его механизмы, особенно в контексте модуляции стресса ЭПР и аутофагии, оставались неисследованными.

Гипоксия, индуцируя окислительный стресс, может нарушать гомеостаз ЭПР, приводя к накоплению misfolded белков и активации ответа на развёрнутые белки (UPR) через три основных сенсора: PERK, IRE1 и ATF6. Длительный или неразрешённый стресс ЭПР через эффектор CHOP инициирует апоптоз. Параллельно гипоксия часто активирует аутофагию — процесс деградации цитоплазматических компонентов, который в условиях стресса может играть как протекторную, так и деструктивную роль. Имеются данные, что истощение пулов GSH провоцирует аутофагию, а его предшественники могут подавлять стресс ЭПР. Это позволило нам выдвинуть гипотезу, что защитное действие GSH при гипоксии может быть связано со способностью модулировать эти взаимосвязанные клеточные стресс-ответы.

Белый амур (Ctenopharyngodon idellus) — высокоценный объект пресноводной аквакультуры, весьма чувствительный к гипоксии. Ранее мы установили, что добавка GSH на уровне 437.85 мг/кг оптимизирует рост молоди этого вида. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы оценить, может ли диетический GSH защитить жабры белого амура от гипоксического повреждения, и исследовать вовлечённые молекулярные механизмы, сфокусировавшись на окислительном стрессе, апоптозе, аутофагии и стрессе ЭПР. Результаты позволят определить оптимальные уровни добавки GSH для повышения гипоксической устойчивости в аквакультурных условиях.

Материалы и методы

Схема эксперимента и гипоксический стресс. Использовались те же шесть экспериментальных рационов с градацией GSH (0.00 – 729.75 мг/кг) и молодь белого амура, что и в предыдущем исследовании роста. После 70 дней выращивания из каждой диетической группы отобрали по 60 рыб и разделили на две подгруппы: нормоксическую (растворённый кислород, РК >6 мг/л, постоянная аэрация) и гипоксическую (РК ~1 мг/л, прерывистая аэрация). Гипоксический стресс длился 96 часов.

Сбор образцов и анализ. По окончании стресс-теста собирали жаберную ткань. Для гистологии и ультраструктурного анализа (ПЭМ) использовали фиксацию в параформальдегиде и глутаральдегиде соответственно. Определяли биохимические показатели: содержание GSH, ROS, MDA, PC, активность антиоксидантных ферментов (SOD, CAT, GSH-Px, GR, GST, GCL). Методом qRT-PCR анализировали экспрессию генов, связанных с апоптозом (bax, caspase-3, -8, -9, xiap, smac, foxa2), аутофагией (ulk1, beclin1, lc3, p62) и стрессом ЭПР (grp78, perk, eif2α, atf4, ire1, xbp1, atf6, chop, hrd1, sel1l). Уровни ключевых белков оценивали с помощью вестерн-блоттинга (P62, LC3b, P-PERK, GRP78, XBP1, CHOP) и иммунофлуоресценции (p-IRE1, Hrd1, Sel1l). Апоптоз визуализировали методом TUNEL.

Статистический анализ. Данные обрабатывали с помощью SPSS 27.0, используя однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA), тест Дункана и t-тест для независимых выборок. Оптимальный уровень добавки GSH определяли с помощью квадратичного регрессионного анализа на основе содержания ROS и PC в жабрах. Уровень значимости – P < 0.05.

Результаты

GSH улучшает продуктивность и системный антиоксидантный статус. Добавка GSH (291.90–583.80 мг/кг) повышала содержание сырого протеина и жира в целой рыбе, коэффициенты утилизации протеина (PRV) и липидов (LPV). Параллельно в кишечнике, печени и мышцах снижались уровни маркеров окислительного повреждения (MDA, PC) и повышалась активность антиоксидантных ферментов (SOD, CAT, GSH-Px и др.). Гистология кишечника и печени подтвердила отсутствие патологий при оптимальном уровне GSH.

GSH улучшает метаболизм и транспорт GSH в жабрах. Гипоксия снижала содержание GSH и активность GCL в жабрах. Добавка GSH (291.90–583.80 мг/кг) дозозависимо нивелировала этот эффект, повышая как уровень GSH, так и активность ключевого фермента его синтеза. Кроме того, GSH усиливал экспрессию генов транспортеров GSH через плазматическую (mrp1, oatpd1) и эндоплазматическую (sec61a1) мембраны.

GSH защищает гистологическую и ультраструктурную целостность жабр. При гипоксии в контрольной группе (0.00 мг/кг GSH) наблюдались тяжелые поражения жабр: отслоение и некроз эпителиальных клеток, слияние вторичных ламелл, их искривление. ПЭМ выявил набухание ЭПР и появление аутофагосом. Добавка 437.85 мг/кг GSH существенно allevировала эти повреждения, сохраняя структуру ткани.

GSH ослабляет окислительный стресс в жабрах при гипоксии. Гипоксия вызывала резкий рост уровней ROS, MDA и PC в жабрах, одновременно подавляя активность SOD, GSH-Px и GR. Добавка GSH (291.90–437.85 мг/кг) эффективно нормализовала эти показатели, демонстрируя мощное антиоксидантное действие на локальном уровне.

GSH ингибирует гипоксией-индуцированный апоптоз в жабрах. Гипоксия увеличивала количество TUNEL-позитивных (апоптотических) клеток и повышала экспрессию проапоптотических генов (bax, caspase-3, -8, -9, smac), одновременно снижая экспрессию антиапоптотического xiap. Добавка GSH (437.85 мг/кг) оказывала противоположный эффект, существенно снижая апоптоз.

GSH подавляет избыточную аутофагию, индуцированную гипоксией. Гипоксия активировала все этапы аутофагического потока: повышала экспрессию генов инициации (ulk1) и нуклеации (beclin1), увеличивала уровень белка LC3b-II (маркер аутофагосом) и снижала уровни мРНК и белка p62 (субстрат деградации при аутофагии). Добавка GSH (291.90–437.85 мг/кг) дозозависимо подавляла эти изменения, указывая на ингибирование всего процесса аутофагии.

GSH allevирует стресс ЭПР, подавляя все три ветви UPR. Гипоксия активировала стресс ЭПР, что проявлялось в повышении уровней мРНК и/или белков ключевых маркеров: GRP78, p-PERK, ATF4, XBP1, ATF6, CHOP, а также компонентов ERAD (Hrd1, Sel1l). Иммунофлуоресценция подтвердила усиление сигналов от p-IRE1, Hrd1 и Sel1l при гипоксии. Добавка GSH (437.85 мг/кг) значимо подавляла активацию всех трёх путей UPR (PERK, IRE1, ATF6) и связанных с ними эффекторов.

Корреляция и определение оптимальной дозы. Корреляционный анализ подтвердил тесную положительную связь между активацией путей UPR (PERK, IRE1, ATF6) и индукцией аутофагии (Beclin1, LC3) при гипоксии. Квадратичный регрессионный анализ показал, что оптимальные уровни диетического GSH для минимизации гипоксического стресса в жабрах, основанные на содержании ROS и PC, составляют 437.10 и 495.00 мг/кг соответственно.

Обсуждение

Наши результаты однозначно демонстрируют, что диетический глутатион обладает выраженным протекторным действием против гипоксического повреждения жабр у белого амура. Улучшение продуктивности и системного антиоксидантного статуса создавало благоприятный физиологический фон для противостояния стрессу. Ключевым открытием является способность GSH не просто повышать общий пул GSH в жабрах, но и усиливать его транспорт и синтез на месте, обеспечивая локальную антиоксидантную защиту непосредственно в целевом органе.

Гипоксия вызывает массивную генерацию АФК, что ведёт к пероксидации липидов (рост MDA) и карбонилированию белков (рост PC). GSH, будучи прямым scavenger АФК и кофактором GSH-Px, эффективно купировал это окислительное повреждение. Более того, предотвращение окислительного стресса, по-видимому, является отправной точкой для модуляции других патологических процессов.

Мы впервые в модели рыб показали, что GSH подавляет гипоксией-индуцированную аутофагию на всех её этапах. Это согласуется с данными о том, что истощение GSH провоцирует аутофагию в других типах клеток. Вероятно, избыточная аутофагия при гипоксии носит деструктивный характер, и её подавление GSH способствует выживанию клеток.

Параллельно GSH эффективно allevировал стресс ЭПР, ингибируя активацию всех трёх сенсоров UPR – PERK, IRE1 и ATF6. Поскольку окислительный стресс и стресс ЭПР тесно взаимосвязаны (окислительная модификация нарушает фолдинг белков), антиоксидантное действие GSH могло предотвратить первичное накопление misfolded белков в ЭПР. Корреляция между маркерами UPR и аутофагии указывает на их перекрёстную регуляцию при гипоксии. Известно, что стресс ЭПР может индуцировать аутофагию для удаления повреждённых органелл. Таким образом, подавление стресса ЭПР GSH могло вторично приводить к ингибированию аутофагии.

Ослабление апоптоза под действием GSH является логичным следствием снижения окислительного стресса, сдерживания деструктивной аутофагии и разрешения стресса ЭПР, поскольку все эти факторы являются мощными индукторами апоптотических путей. Повышение уровня Xiap и снижение Smac под действием GSH указывает на прямое воздействие на митохондриальный апоптотический механизм.

Небольшое расхождение в оптимальных дозах, рассчитанных по ROS (437.10 мг/кг) и PC (495.00 мг/кг), вероятно, отражает тот факт, что нейтрализация ROS – более прямой и быстрый процесс, в то время как предотвращение и/или восстановление карбонилированных белков требует более высокой и продолжительной антиоксидантной поддержки.

Заключение

Диетическая добавка глутатиона в диапазоне 291.90–437.85 мг/кг эффективно защищает жабры молоди белого амура от структурного и функционального повреждения, вызванного гипоксическим стрессом. Механизм этого защитного действия является многокомпонентным и включает:

1. Усиление системной и локальной (жаберной) антиоксидантной защиты.

2. Подавление гипоксией-индуцированного стресса эндоплазматического ретикулума через ингибирование всех трёх ветвей сигнального пути UPR (PERK, IRE1, ATF6).

3. Ингибирование избыточной деструктивной аутофагии на этапах инициации, нуклеации, элонгации и деградации.

4. Ослабление апоптоза за счёт модуляции экспрессии про- и антиапоптотических факторов.

На основании маркеров окислительного повреждения оптимальным уровнем добавки GSH для повышения устойчивости молоди белого амура к гипоксии рекомендуется 437.10 – 495.00 мг/кг рациона. Полученные данные дают глубокое понимание молекулярных основ защитного действия глутатиона и обосновывают его применение в качестве эффективной функциональной кормовой добавки в аквакультуре для смягчения последствий гипоксических событий.

Исследование: Journal of Animal Science and Biotechnology