Характеристика и анализ генома нового изолята Chryseobacterium sp., обнаруженного в местах массовой гибели карпа

Бактерии рода Chryseobacterium, относящиеся к семейству Flavobacteriaceae, представляют собой грамотрицательные, неподвижные, не образующие спор микроорганизмы, широко распространенные в природе. Эти бактерии способны вызывать широкий спектр заболеваний у человека, домашней птицы и растений, а также наносить значительный ущерб аквакультуре. У рыб инфекции, вызванные Chryseobacterium sp., проявляются в виде диффузных или локальных геморрагий на поверхности тела, что часто приводит к отслоению чешуи. Подобные вспышки не только снижают экономическую эффективность рыбных хозяйств, но и ухудшают экологическую обстановку в водоемах. Распространенность этих бактерий в водных источниках и продуктах питания также создает потенциальную угрозу для здоровья населения, привлекая все большее внимание исследователей.

Одним из ключевых объектов пресноводной аквакультуры в Китае является обыкновенный карась (Carassius gibelio). Однако интенсивное развитие рыбоводства привело к распространению инфекционных заболеваний. Наиболее распространены бактериальные инфекции, среди которых особо опасной считается бактериальная септицемия, вызванная Aeromonas. В то же время случаи заражения карася Chryseobacterium sp. в силу специфических условий роста этого патогена встречаются крайне редко.

В последние годы в прудовых хозяйствах Китая участились случаи так называемого «синдрома зимовки» пресноводных рыб. Заболевание проявляется в период с февраля по апрель при температуре воды от 10 до 20 °C и приводит к массовой гибели таких видов, как белый амур, карп и карась, нанося существенный экономический ущерб. В марте 2024 года в ходе обследования рыбоводческих хозяйств в городе Яньчэн (провинция Цзянсу, Китай) у больных особей карася были отмечены характерные клинические признаки: гиперемия и язвы в области головы и рта, а также множественные кровоизлияния на теле. В данном исследовании мы впервые сообщаем о выделении Chryseobacterium sp. от карася с клиническими признаками «синдрома зимовки», а также представляем результаты полногеномного секвенирования и анализа выделенного изолята. Эти данные имеют важное значение для изучения патогенеза, разработки методов профилактики и лечения данного заболевания.

Материалы и методы

Образцы и выделение бактерий. Заболевшие гибриды карася (массой 50 ± 10 г и длиной 15 ± 3 см) с типичными симптомами (покраснение головы и ротовой полости) были отобраны в марте 2024 года на одной из ферм в Яньчэне. В асептических условиях проводили препарирование рыб, после чего кусочки тканей печени, селезенки и почек помещали на чашки с агаром Shieh. Инкубацию осуществляли при температуре 16 °C в течение 48 часов. Характерные колонии отбирали и очищали методом штриховых посевов. Чистый изолят культивировали и хранили в жидкой среде Shieh с добавлением 20% глицерина при температуре -80 °C.

Морфологические и физиолого-биохимические исследования. Морфологию колоний изучали после 48 часов культивирования на агаре Shieh. Окрашивание по Граму проводили по стандартной методике. Для сканирующей электронной микроскопии бактериальные клетки фиксировали, обезвоживали в серии ацетоновых растворов, высушивали и напыляли золотом, после чего изучали на микроскопе SU8100. Физиолого-биохимическую идентификацию проводили с использованием соответствующих тест-систем, ориентируясь на данные «Определителя бактерий Берджи».

Идентификация по гену 16S рРНК. Геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора. Ген 16S рРНК амплифицировали методом ПЦР с универсальными праймерами (27F и 1492R). Полученные продукты секвенировали, и полученные последовательности сравнивали с данными базы GenBank с помощью инструмента BLAST. Филогенетическое древо строили методом присоединения соседей в программе MEGA7.0, оценивая достоверность ветвления с помощью 1000 бутстрэп-повторов.

Оценка чувствительности к антибиотикам и гемолитической активности. Чувствительность к антимикробным препаратам определяли методом бумажных дисков. Бактериальную суспензию наносили на поверхность агара Shieh, после чего помещали диски с котримоксазолом, неомицином, флорфениколом, энрофлоксацином и доксициклином. Результаты оценивали после 48 часов инкубации при 16 °C, измеряя диаметр зон ингибирования.

Гемолитическую активность определяли двумя способами. В первом случае надосадочную жидкость культуры смешивали с суспензией эритроцитов овцы, инкубировали и измеряли оптическую плотность. Во втором случае изолят высевали на кровяной агар, инкубировали и оценивали наличие и прозрачность зон гемолиза. В качестве положительного контроля использовали Aeromonas hydrophila.

Экспериментальное заражение. Для подтверждения патогенности выделенного штамма был проведен регрессионный тест на здоровых гибридах карася (40 ± 3 г). Рыб случайным образом разделили на пять групп (по три аквариума в каждой, n=10). Четырем группам внутрибрюшинно вводили бактериальную суспензию в различных концентрациях (от 1 × 10⁴ до 1 × 10⁷ КОЕ/мл), а контрольной группе вводили физиологический раствор. В течение 7 дней после заражения регистрировали клинические симптомы и летальность.

Полногеномное секвенирование и анализ. Геномную ДНК очищенного изолята секвенировали с использованием комбинации платформ PacBio (секвенирование SMRT) и Illumina (парноконцевое секвенирование). Полученные данные были собраны de novo с последующей коррекцией. Аннотацию генома проводили с использованием конвейера Prokka и инструментов NCBI. В ходе анализа прогнозировали открытые рамки считывания, некодирующие РНК, острова патогенности, профаги, элементы CRISPR, а также проводили функциональную аннотацию в базах данных GO, KEGG, COG, Pfam, CARD, CAZy и PHI-base. Дополнительно прогнозировали системы секреции, двухкомпонентные системы регуляции, кластеры генов вторичных метаболитов и факторы вирулентности.

Результаты

Клиническая картина и гистопатология. У заболевших рыб, отловленных в прудах с температурой воды 16 ± 2 °C, наблюдались типичные признаки: они плавали поодиночке, снизили аппетит. Внешне отмечались покраснение, отек и язвы в ротовой полости, а также кровоизлияния в области головы и глаз. При вскрытии в брюшной полости обнаруживался прозрачный асцит, а кишечник был гиалиновым и легко разрывался.

Гистологическое исследование внутренних органов больных рыб выявило выраженные патологические изменения. В печени наблюдалось нарушение структуры гепатоцитов с потерей ядер и внутриклеточного вещества. В селезенке отмечались некротические изменения, увеличение количества эритроцитов в интерстиции и отложения ферритина. В почках структура канальцев и клубочков была нарушена, наблюдались кровоизлияния и атрофия клеток. В кишечнике выявлено нарушение плотности эпителиального слоя, некроз бокаловидных клеток и расширение межклеточных пространств.

Характеристика изолята. В результате бактериологического посева из тканей почек больных рыб был выделен доминирующий штамм, получивший обозначение YC-874. На плотной питательной среде он формировал круглые, выпуклые колонии желтого цвета с гладкими краями. Окраска по Граму показала, что бактерия является грамотрицательной и имеет форму коротких палочек длиной 1,0–2,0 мкм и шириной 0,3–0,6 мкм. Жгутики отсутствовали. При культивировании в жидкой среде на дне пробирки образовывался осадок желтого цвета. Физиолого-биохимические свойства изолята, включая способность к продукции желтого пигмента, утилизацию глюкозы, гидролиз эскулина и отрицательные реакции на VP-MR и мочевину, полностью соответствовали характеристикам рода Chryseobacterium.

Молекулярно-генетическая идентификация. Амплификация гена 16S рРНК дала продукт длиной около 1500 п.н. Анализ его нуклеотидной последовательности показал 99,93% идентичности с последовательностями Chryseobacterium sp., депонированными в GenBank. Филогенетический анализ подтвердил, что изолят YC-874 входит в кластер, соответствующий роду Chryseobacterium. На основании совокупности морфологических, культуральных, биохимических и молекулярных данных изолят YC-874 был идентифицирован как Chryseobacterium sp.

Антибиотикочувствительность и гемолитическая активность. Тест на чувствительность к пяти распространенным в аквакультуре антибиотикам показал, что изолят YC-874 чувствителен только к котримоксазолу, умеренно чувствителен к энрофлоксацину и устойчив к доксициклину, флорфениколу и неомицину.

Исследование гемолитической активности продемонстрировало, что изолят обладает способностью к гемолизу, хотя и менее выраженному, чем у A. hydrophila. В тесте с эритроцитами овцы гемолитическая активность YC-874 составила около 50% от положительного контроля. На кровяном агаре также наблюдались видимые, но не полностью прозрачные зоны гемолиза, что указывает на способность бактерии продуцировать гемолизины.

Результаты экспериментального заражения. В ходе регрессионного теста ни в одной из экспериментальных групп не было зафиксировано летальных исходов в течение 7 дней. У зараженных рыб не развились характерные симптомы «красной головы» и «красного рта», однако наблюдались потеря чешуи, усиление слизеобразования на жаберных нитях и незначительные повреждения жабр. Из тканей рыб, которым вводили бактериальную суспензию, вновь был выделен Chryseobacterium sp., что подтвердило успешность заражения, но не выявило высокой летальности патогена в лабораторных условиях.

Характеристика генома. Полногеномное секвенирование показало, что геном Chryseobacterium sp. YC-874 представлен одной кольцевой хромосомой длиной 5 320 090 пар оснований с содержанием GC 36,17%. Плазмид обнаружено не было. В геноме было предсказано 4775 кодирующих белки генов со средним содержанием GC 37,24%. Среди повторяющихся элементов выявлены 99 интерсперсных и 157 тандемных повторов. Также идентифицированы 2 CRISPR-кассеты, 8 геномных островов и 2 профага. Некодирующие РНК были представлены 18 генами рРНК (5S, 16S, 23S), 98 генами тРНК и 2 малыми РНК.

Функциональная аннотация показала, что гены распределены по 25 из 26 категорий COG. Анализ путей KEGG позволил отнести 1555 генов к 12 метаболическим путям, среди которых преобладали пути, связанные с общим метаболизмом, метаболизмом аминокислот и углеводов. В категориях, касающихся клеточных процессов, информационной и средовой обработки, наиболее высокую долю составили гены, отвечающие за трансляцию, передачу сигналов, клеточные взаимодействия и адаптацию.

Анализ GO показал, что в категории «биологический процесс» доминируют клеточные и метаболические процессы; в категории «клеточный компонент» — клеточные структуры и белковые комплексы; а в категории «молекулярная функция» — каталитическая активность и связывание.

Факторы вирулентности и резистентности. Детальный анализ генома выявил множество генов, связанных с патогенностью. В частности, идентифицированы гены, кодирующие факторы адгезии, образования биопленок, гемолиза (включая гены hlyD) и подвижности (гены семейств gld, spr и por). В геноме YC-874 предсказаны три системы секреции (T3SS, T6SS и T9SS). Наличие системы T9SS особенно важно, так как она часто ассоциирована со скользящей подвижностью и вирулентностью у бактерий, родственных Flavobacteriaceae. Кроме того, в геноме обнаружено 26 двухкомпонентных систем регуляции, 10 кластеров генов вторичных метаболитов, а также 332 гена, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам. Гены резистентности, выявленные с использованием базы CARD, соответствуют устойчивости к фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, а также включают гены, кодирующие белки множественной лекарственной устойчивости, что полностью коррелирует с данными фенотипического тестирования.

Обсуждение

В ходе данного исследования был впервые выделен и идентифицирован Chryseobacterium sp. от больного карася с клиническими признаками «синдрома зимовки». Ранее различные виды этого рода, такие как C. indologenes, C. scophthalmum, C. cucumeris и C. aquaticum, были описаны как патогены для других видов рыб и водных организмов. Патогенность этих бактерий варьируется и часто зависит от условий окружающей среды и состояния иммунной системы хозяина. В нашем исследовании, как и в работах других авторов, Chryseobacterium sp. YC-874 вызвал у рыб клинические проявления (повреждения тканей, изменения поведения), но не привел к летальному исходу в условиях экспериментального заражения. Это позволяет предположить, что Chryseobacterium sp. может действовать как оппортунистический патоген. Вероятно, в естественных условиях массовая гибель рыбы при «синдроме зимовки» связана с сочетанным действием нескольких факторов: сезонным снижением температуры, ослаблением иммунитета рыб, недостатком кормов и возможной ко-инфекцией с другими патогенами. Устойчивость Chryseobacterium к низким температурам позволяет ему активно размножаться в холодной воде, что в совокупности с иммуносупрессией хозяина может приводить к тяжелым вспышкам.

Чувствительность изолята YC-874 к котримоксазолу, отмеченная в нашем исследовании, согласуется с данными о чувствительности других водных изолятов Chryseobacterium к сульфаниламидным препаратам. Это позволяет рекомендовать котримоксазол в качестве потенциального средства терапии при вспышках, вызванных данным патогеном. Однако высокая устойчивость к доксициклину, флорфениколу и неомицину подчеркивает важность предварительного тестирования перед назначением антибиотиков.

Полногеномное секвенирование предоставило уникальную возможность для анализа молекулярных основ вирулентности и резистентности этого патогена. Обнаружение в геноме YC-874 генов, кодирующих системы секреции (особенно T9SS), гемолизины, факторы скользящей подвижности и белки, участвующие в формировании биопленок, указывает на значительный патогенный потенциал бактерии. Широкий спектр генов антибиотикорезистентности, выявленный при геномном анализе, полностью объясняет устойчивость к нескольким классам антибиотиков, наблюдаемую in vitro. Таким образом, полученные геномные данные не только подтверждают результаты фенотипических тестов, но и создают основу для будущих исследований молекулярных механизмов взаимодействия Chryseobacterium sp. с организмом рыбы.

Заключение

В результате проведенного исследования из больного карася с клиническими признаками «синдрома зимовки» был выделен и идентифицирован новый изолят Chryseobacterium sp. YC-874. Бактерия обладает характерными морфологическими, культуральными и генетическими признаками, свойственными роду Chryseobacterium. Штамм YC-874 проявил чувствительность к котримоксазолу и умеренную чувствительность к энрофлоксацину, что позволяет рассматривать эти препараты в качестве средств выбора при разработке стратегий лечения. Отсутствие летальности в эксперименте по искусственному заражению указывает на то, что развитие тяжелой формы заболевания, вероятно, требует участия дополнительных стресс-факторов, характерных для зимне-весеннего периода. Полногеномное секвенирование выявило в геноме изолята широкий арсенал генов, ассоциированных с вирулентностью, подвижностью, формированием биопленок и устойчивостью к антимикробным препаратам. Эти данные закладывают этиологическую основу для дальнейшего изучения патогенеза, мониторинга и контроля заболеваний рыб, вызываемых Chryseobacterium sp., и подчеркивают необходимость комплексного подхода к профилактике «синдрома зимовки» в аквакультуре.


Источник: Aquaculture Reports