Влияние соотношения белка и энергии в рационе радужной форели и карбоната кальция на микробиоту кишечника через изменения в химусе и усвояемости питательных веществ

Эффективность выращивания рыбы в аквакультуре напрямую зависит от качества кормов и их усвоения организмом. Одним из ключевых, но часто недооцениваемых параметров корма является его буферная емкость — способность противостоять резким изменениям кислотности (pH) в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Хотя для свиней, птицы и жвачных животных этот фактор изучен достаточно хорошо, в рыбоводстве ему долгое время не уделяли должного внимания. Однако современные тенденции в производстве аквакормов заставляют пересмотреть этот вопрос. С одной стороны, активно идет замена дорогостоящей рыбной муки на растительные компоненты (злаки, сою). С другой стороны, оптимизация рационов часто ведет к снижению уровня белка. Оба этих процесса могут существенно изменить буферную способность корма, а значит, и среду в кишечнике рыбы, что неизбежно скажется на работе пищеварительных ферментов и микробном сообществе.

Предыдущие исследования уже показали, что минеральные добавки, такие как карбонат кальция (CaCO3), обладающий высокой буферностью, могут компенсировать эти изменения. Например, включение 3% CaCO3 в корм для европейского морского окуня восстановило буферные свойства рациона с низким содержанием рыбной муки. В нашей предыдущей работе на радужной форели мы установили, что как добавление CaCO3, так и повышение соотношения белка и энергии (P:E) в корме увеличивают буферную емкость, регулируют влажность и pH содержимого кишечника (химуса), а также влияют на усвояемость питательных веществ и скорость роста рыбы.

Поскольку pH и скорость продвижения корма напрямую влияют на бактериальную среду, мы предположили, что эти диетические факторы способны менять состав микробиоты кишечника. Настоящее исследование является продолжением работы Ciavoni et al. (2023) и ставит целью выяснить, как соотношение P:E и добавки CaCO3 влияют на микробное разнообразие и структуру сообществ в разных отделах кишечника форели, и как эти изменения связаны с физиологией пищеварения.

Материалы и методы

Эксперимент был проведен в исследовательском центре Вагенингенского университета (Нидерланды). Радужную форель (Oncorhynchus mykiss) со средней начальной массой 284 г разместили в 24 аквариумах по 23 особи в каждом. Рыб кормили вручную дважды в день в течение 6 недель — срока, достаточного для адаптации пищеварения к новым рационам.

Были разработаны четыре экспериментальных рациона, различающихся по двум ключевым параметрам:

1. Соотношение белка и энергии (P:E): «Низкое» (16,1 мг/кДж) и «Высокое» (26,4 мг/кДж). Высокое соотношение достигалось за счет увеличения доли белка (пшеничный глютен, соевый и гороховый концентраты) и снижения доли энергетических компонентов (крахмал, жир).

2. Наличие карбоната кальция (CaCO3): Рационы без добавки и с добавлением 3% CaCO3.

Таким образом, сформировалось 4 группы кормов (Рисунок 1):

- LP:E-LC (низкий P:E, без CaCO3);

- LP:E-HC (низкий P:E, с CaCO3);

- HP:E-LC (высокий P:E, без CaCO3);

- HP:E-HC (высокий P:E, с CaCO3).

Для отслеживания усвояемости в корма добавили инертный маркер — оксид иттрия (Y2O3). В конце эксперимента пробы отбирали в два временных промежутка после кормления (3 и 7 часов), чтобы оценить динамику пищеварения.

Сбор образцов и анализы

Рыб усыпляли, после чего проводили забор содержимого (химуса) из двух отделов кишечника: проксимального (начальный отдел, сразу после пилорических придатков) и дистального (задний отдел, ближе к анусу). Для микробиологического анализа у трех рыб из каждого аквариума (всего 9 рыб на условие) отбирали небольшие фрагменты тканей тех же отделов, которые консервировали для последующего выделения ДНК.

Химус анализировали на pH, содержание сухого вещества, азота (белка) и минеральных веществ (Ca, P, Mg, Na, K). На основе этих данных и концентрации маркера рассчитывали коэффициенты видимой усвояемости питательных веществ (ADC) и относительные потоки воды и ионов.

Для анализа микробиоты выделяли ДНК из образцов тканей, а затем проводили секвенирование участка гена 16S рРНК на платформе Illumina MiSeq. Полученные данные обрабатывали с помощью современных биоинформатических инструментов (DADA2), определяя варианты последовательностей (ампликонов) и их таксономическую принадлежность по базе SILVA. Статистический анализ включал оценку альфа-разнообразия (богатство по Chao1 и разнообразие по Simpson) и бета-разнообразия (различия между сообществами с использованием метрик Жаккара и Брея-Кертиса).

Результаты

Как и в предыдущем исследовании, рыба, получавшая корма с высоким соотношением P:E и без добавления CaCO3 (HP:E-LC), показала наилучшие результаты: максимальную скорость роста и минимальный коэффициент конверсии корма. Само по себе добавление CaCO3 несколько снижало эти показатели. Важно, что потребление корма не различалось между группами, значит, наблюдаемые эффекты связаны именно с физиологией пищеварения.

Альфа-разнообразие: богатство и равномерность микробиоты

Анализ альфа-разнообразия показал, что состав рациона (соотношение P:E и наличие CaCO3) и время после кормления не оказали значимого влияния на богатство (индекс Chao1) и разнообразие (индекс Симпсона) микробных сообществ в кишечнике форели (P > 0.05).

Единственным фактором, который повлиял на разнообразие, оказался отдел кишечника (P = 0.007). Индекс Симпсона был достоверно выше в проксимальном отделе, чем в дистальном (Рисунок 2). Это указывает на то, что в начальном отделе кишечника микробное сообщество не только богаче (тенденция, P=0.09), но и более сбалансировано по численности разных видов. Дистальный отдел характеризовался меньшим разнообразием, что, вероятно, связано с доминированием ограниченного числа наиболее приспособленных к местным условиям бактерий.

Бета-разнообразие: структура микробных сообществ

В отличие от альфа-разнообразия, структура сообществ (бета-разнообразие) оказалась чувствительна к диете. Анализ с использованием метрики Жаккара (учитывающей качественный состав — присутствие или отсутствие видов) выявил значимое влияние соотношения P:E (P = 0.001), добавок CaCO3 (P = 0.002) и, что наиболее важно, их взаимодействия (P = 0.007).

Нагляднее всего это проявилось в том, что микробиота рыб из группы HP:E-LC (высокий белок, без кальция) формировала отдельный, обособленный кластер на графике (Рисунок 3A). Это значит, что набор бактериальных видов в кишечнике этой группы принципиально отличался от остальных трех, которые были схожи между собой.

Кроме того, диета повлияла на вариабельность сообществ. В группах с высоким содержанием белка (HP:E-LC и HP:E-HC) индивидуальные различия между рыбами были значительно ниже, чем в группах с низким содержанием белка (Рисунок 3B). Диета с высоким P:E как бы «стандартизировала» качественный состав микробиоты, делая его более единообразным у всех особей.

Анализ с метрикой Брея-Кертиса (учитывающей также численность видов) подтвердил, что самое сильное различие в структуре микробиоты существует между проксимальным и дистальным отделами кишечника (P = 0.001), объясняя до 40% всех различий (Таблица 1). Влияние диеты на количественный состав было незначимым.

Таксономический состав: кто живет в кишечнике форели?

Несмотря на различия в структуре, общий таксономический профиль был удивительно стабилен. На уровне типа (филума) безоговорочно доминировали Firmicutes, составляя 84-95% всех бактерий (Рисунок 4A). На уровне рода главенствующее положение занимали две группы:

- Mycoplasma: абсолютный лидер (61-88% в зависимости от отдела). Этот род считается комменсалом лососевых, предположительно участвуя в синтезе витаминов и аминокислот, а также в ферментации.

- Lactobacillus: второй по значимости род (4-26%).

Изменения под влиянием диеты коснулись лишь минорных групп. Добавление CaCO3 привело к снижению численности типа Desulfobacterota (сульфатредуцирующие бактерии) в проксимальном отделе, особенно в группе с низким содержанием белка. Повышение уровня белка (рацион HP:E-LC) снижало количество типа Bacteroidota и рода Phaeodactylibacter, что, вероятно, связано с изменением количества углеводов и жиров, поступающих в кишечник.

Также было замечено, что в группе HP:E-LC в проксимальном отделе появлялся род Geobacillus (0.21%), отсутствовавший в других группах. Этот род интересен тем, что некоторые его штаммы обладают фитазной активностью, то есть способны расщеплять фитаты (антинутриенты растительных кормов), высвобождая связанные с ними минералы.

Связь микробиоты с физиологией пищеварения

Корреляционный анализ позволил связать изменения в микробиоте с процессами пищеварения.

1. Отделы кишечника: Различия в структуре микробиоты между проксимальным и дистальным отделами были тесно связаны с разницей в потоках воды и ионов (Na, K, Ca), pH химуса и усвояемости белка. Это подтверждает, что локальные физико-химические условия (среда) определяют, какие бактерии могут там обитать, и наоборот.

2. Geobacillus и усвояемость магния: Появление Geobacillus в группе HP:E-LC положительно коррелировало с повышением усвояемости магния (Mg ADC) в проксимальном отделе (Рисунок 5). Это поддерживает гипотезу о том, что бактерия помогает рыбе получать больше минералов из растительного сырья.

3. Megasphaera и усвояемость цинка: Обнаружена отрицательная корреляция между численностью рода Megasphaera и усвояемостью цинка. Хотя причина этой связи не ясна, она согласуется с данными по свиноводству, где цинк часто подавляет рост этих бактерий.

Обсуждение

Наше исследование показало, что диета, меняя буферные свойства корма и состав макронутриентов, способна влиять на микробиоту кишечника форели. Однако это влияние носит тонкий, модулирующий характер, не нарушая общего гомеостаза.

Главный вывод: отдел кишечника является более сильным фактором формирования микробиоты, чем диета. Проксимальный и дистальный отделы — это две разные экологические ниши. В проксимальном отделе, куда только поступает химус, выше разнообразие бактерий. Дистальный отдел, где идет активное всасывание воды и формирование фекалий, заселен более специализированным и менее разнообразным сообществом, где доминируют Firmicutes. Это согласуется с данными по другим видам рыб.

Влияние диеты проявилось на уровне качественного состава (наличия/отсутствия редких видов), но не затронуло основные, количественно доминирующие группы, такие как Mycoplasma. Это важный признак здоровья. Постоянство доминирующей микробиоты говорит о том, что все испытанные рационы были физиологичны и не вызывали дисбактериоза.

Наиболее интересные изменения произошли с минорными таксонами, которые можно рассматривать как тонкие индикаторы состояния среды.

- Эффект CaCO3 и pH: Снижение численности Desulfobacterota при добавлении CaCO3, вероятно, связано с повышением pH в проксимальном отделе (с ~7.0 до 7.2), вызванным буферной способностью карбоната кальция. Многие сульфатредукторы, включая потенциально опасных Desulfovibrio, предпочитают более кислую среду. Это демонстрирует, как минеральная добавка через простой сдвиг pH может подавлять рост определенных групп бактерий.

- Эффект состава макронутриентов: Снижение Bacteroidota и Phaeodactylibacter при высокобелковой диете логично объясняется уменьшением количества углеводов и жиров — основных субстратов для этих групп.

- Случай Geobacillus: Появление Geobacillus только в группе HP-E-LC (высокий белок, без CaCO3) и его корреляция с усвояемостью магния открывает перспективу для поиска пробиотиков. Возможно, в условиях повышенного содержания растительных ингредиентов (и, соответственно, фитатов) в кишечнике создается ниша для фитазопродуцирующих бактерий. Исчезновение Geobacillus при добавлении CaCO3, вероятно, связано с неблагоприятным для него повышением pH. Это подчеркивает важность баланса при составлении рационов.

Интересно также наблюдение, что высокобелковая диета снижает межиндивидуальную вариабельность микробиоты. Рыбы, питающиеся одинаковым кормом с высоким содержанием белка, становятся более похожи друг на друга по набору кишечных бактерий, чем рыбы на низкобелковом корме. Причиной может быть мощное селективное давление высокого содержания белка и аминокислот, которое «отсеивает» случайные вариации и формирует более консервативное, стабильное сообщество, ориентированное на утилизацию этого субстрата.

Заключение

Данное исследование впервые комплексно связало диетические факторы (буферные свойства и соотношение P:E), физиологию пищеварения (потоки веществ, pH, усвояемость) и состав микробиоты кишечника радужной форели.

Мы пришли к следующим основным выводам:

1. Соотношение белка и энергии в корме и добавки карбоната кальция влияют на качественный состав кишечной микробиоты, преимущественно на минорные таксоны, оставляя ядро сообщества (Firmicutes, Mycoplasma) стабильным.

2. Влияние CaCO3 в значительной степени опосредовано изменением pH кишечного содержимого.

3. Влияние соотношения P:E связано с изменением доступности субстратов (углеводы, жиры, белок) для бактерий.

4. Отдел кишечника (проксимальный vs дистальный) является ключевым фактором, определяющим структуру и разнообразие микробного сообщества.

Практическая значимость работы заключается в том, что она показывает возможность тонкой настройки кишечной микробиоты с помощью рациона. Понимание того, как буферные компоненты и уровень белка меняют микробный ландшафт, позволяет разрабатывать функциональные корма, направленные на улучшение усвоения минералов (как в случае с Geobacillus) или подавление нежелательных групп (как в случае с Desulfobacterota). Обнаруженные корреляции открывают новые направления для поиска пробиотических штаммов и биомаркеров пищеварения.

Необходимы дальнейшие исследования на морских видах, где осморегуляция накладывает свой отпечаток на физиологию кишечника, чтобы понять универсальность обнаруженных закономерностей. Тем не менее, работа вносит существенный вклад в понимание сложных взаимосвязей в системе «корм — кишечник — микробиом — рост» у лососевых рыб.

Исследование: Animal