Изменение гематологических и биохимических показателей сыворотки крови радужной форели, во время вспышки цитробактериоза

Современное мировое рыболовство и аквакультура играют стратегическую роль в обеспечении населения планеты высококачественным белком животного происхождения. Рыба, как пищевой продукт, отличается не только высокой пищевой ценностью, но и экологической устойчивостью производства, что делает её важнейшим элементом концепции «зелёной экономики». В этом контексте аквакультура Индии, занимающей второе место в мире по объёму производства рыбоводной продукции, демонстрирует устойчивый рост и привлекает значительные государственные и частные инвестиции.

Среди культивируемых видов особое место принадлежит радужной форели (Oncorhynchus mykiss), которая была интродуцирована в Индийские Гималаи ещё в начале XX века и успешно адаптировалась к местным условиям. Данный вид ценится за высокие темпы роста, отличные вкусовые качества, устойчивость к заболеваниям и относительную неприхотливость к условиям выращивания. Однако, несмотря на технологические достижения, сектор сталкивается с серьёзными проблемами, связанными с ростом плотности посадки, ухудшением гидрохимического режима и, как следствие, увеличением частоты инфекционных вспышек.

Особую тревогу вызывает рост заболеваемости цитробактериозом — бактериальной инфекцией, вызываемой микроорганизмами рода Citrobacter. Ранее основные бактериальные патогены в форелеводстве были представлены родами Aeromonas, Vibrio и Flavobacterium. Однако в последние годы именно Citrobacter freundii и Citrobacter gillenii всё чаще выделяются от больной рыбы с клиническими признаками генерализованного поражения. Заболевание проявляется геморрагиями, язвенными поражениями кожных покровов, эрозией плавников и полиорганной недостаточностью, что приводит к высокому уровню смертности и значительным экономическим потерям.

Несмотря на возрастающую значимость цитробактериоза, системных исследований, посвящённых изучению его патогенетического влияния на гематологический и биохимический статус организма рыбы, крайне недостаточно. Между тем, именно показатели крови являются наиболее информативными индикаторами физиологического состояния, отражающими интегральный ответ организма на стрессовые воздействия, включая инфекционный процесс. Гематологические и биохимические маркеры давно и успешно применяются в ветеринарии и рыбоводстве для оценки стресса, токсического воздействия, паразитарных инвазий, нарушений кормления и экологических отклонений.

Актуальность настоящей работы обусловлена необходимостью восполнения пробела в понимании патофизиологических механизмов цитробактериоза у радужной форели. Цель исследования заключалась в комплексной оценке изменений гематологических и биохимических показателей сыворотки крови у рыбы, поражённой Citrobacter gillenii и Citrobacter freundii, в условиях естественной вспышки, а также в определении диагностического потенциала этих параметров для раннего выявления и контроля заболевания.

1. Материалы и методы

1.1. Объект и место исследования

Исследование проводилось в июне 2024 года на базе Лярибальской форелевой фермы (Laribal Trout Farm), расположенной на территории национального парка Дачигам (штат Джамму и Кашмир, Индия). Ферма является одним из крупнейших и наиболее технически оснащённых форелевых хозяйств в Азии, её водоснабжение осуществляется за счёт вод горного ручья, вытекающего из высокогорного ледникового озера Марсар.

Для анализа были отобраны две группы радужной форели (по 30 особей в каждой): первая группа — рыбы с выраженными клиническими признаками заболевания (вялость, анорексия, изменение окраски, язвы, асцит), вторая — клинически здоровые особи без видимых отклонений. Основные гидрохимические параметры воды на момент отбора проб поддерживались в пределах, оптимальных для культивирования форели: температура 10,75 ± 2,85 °C, растворённый кислород 9,31 ± 1,19 мг/л, pH 7,64 ± 0,29.

1.2. Клинический осмотр и микробиологическая идентификация

Все особи подвергались детальному внешнему осмотру с оценкой состояния кожных покровов, плавников, жаберного аппарата и поведения. После эвтаназии проводилось вскрытие с исследованием внутренних органов: печени, селезёнки, почек, кишечника. Для бактериологического анализа образцы тканей от больных рыб высевались на питательные среды (агар МакКонки, кровяной агар, питательный агар), культивировались при 28 °C в течение 24 часов с последующим выделением чистых колоний. Идентификация проводилась с использованием классических биохимических тестов (наборы HIMEDIA) и молекулярно-генетического анализа 16S рРНК.

1.3. Молекулярная диагностика

Геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора HipurA™ Bacterial DNA purification kit. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК выполняли с помощью универсальных праймеров 27F и 1492R. Условия ПЦР включали начальную денатурацию при 95 °C, 32 цикла с отжигом при 42 °C и финальную элонгацию. Продукты амплификации разделяли в 1,5% агарозном геле, секвенирование проводили методом Сэнгера на приборе 3500 XL-ABI. Полученные нуклеотидные последовательности подвергали BLAST-анализу и депонировали в GenBank. Филогенетический анализ выполняли с использованием программ MEGA 11 и DnaSP6.

1.4. Отбор и обработка образцов крови

Забор крови производили из хвостовой вены с использованием шприца объёмом 4 мл и иглы 23G. Для предотвращения стресса рыбу предварительно подвергали лёгкой седации с помощью MS-222. Кровь разделяли на две порции: одна помещалась в вакуумные пробирки с гепарином для гематологического исследования, другая — в пробирки без антикоагулянта для получения сыворотки. Центрифугирование проводили в течение 3 минут при 14 000 g.

1.5. Гематологический анализ

Определяли следующие показатели: концентрация гемоглобина (Hb) цианметгемоглобиновым методом, гематокрит (Hct) методом микрокапиллярного центрифугирования, общее количество эритроцитов (RBC) и лейкоцитов (WBC) с помощью гемоцитометра. Эритроцитарные индексы — средний объём эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) и средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC) — рассчитывали по стандартным формулам.

1.6. Биохимический анализ сыворотки

Сывороточные биохимические показатели оценивали с помощью автоматического биохимического анализатора Vet Scan VS2. Определяли концентрацию глюкозы, общего белка, альбумина, глобулина, триглицеридов, общего холестерина, креатинина, мочевины (BUN), а также активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и креатинкиназы. Дополнительно измеряли уровни кальция и фосфора с использованием соответствующих реагентных роторов.

1.7. Статистическая обработка

Все расчёты выполнены в среде R Studio. Для проверки нормальности использовали тест Шапиро–Уилка. В связи с ненормальным распределением большинства переменных, для межгрупповых сравнений применяли непараметрический ранговый критерий Уилкоксона. Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена с визуализацией матриц. Метод главных компонент применяли для оценки многомерной структуры данных и дифференциации групп. Статистически значимыми считали различия при P < 0.05.

2. Результаты

2.1. Клиническая и микробиологическая картина

Больные особи демонстрировали широкий спектр патологических изменений: генерализованные внутренние и наружные геморрагии, вздутие брюшной полости, множественные язвы на коже, скопление асцитической жидкости в брюшной полости, обесцвечивание покровов, эрозии плавников и признаки энтерита. При паразитологическом контроле ни у одной из отловленных рыб не было выявлено паразитарной инвазии, что позволило исключить сочетанное воздействие паразитов как причину заболевания. Водные параметры также не выходили за пределы физиологических норм для форели, что позволило исключить их роль в качестве первичного стресс-фактора.

Биохимическая идентификация выделенных культур позволила установить их принадлежность к грамотрицательным палочкам семейства Enterobacteriaceae. Молекулярное секвенирование фрагмента 16S рРНК показало, что штамм LKRT11 демонстрирует 99,56% идентичности с Citrobacter gillenii, а штамм LKRT01 — 100% идентичности с Citrobacter freundii. Полученные последовательности депонированы в базе данных GenBank. Филогенетический анализ подтвердил принадлежность выделенных изолятов к роду Citrobacter и показал их тесное эволюционное родство со штаммами, ранее описанными при аналогичных эпизоотиях.

2.2. Гематологические изменения

В результате сравнительного анализа были выявлены достоверные различия между группами здоровой и больной рыбы. У больных особей отмечалось статистически значимое снижение концентрации гемоглобина (в среднем 6,55 г/дл против 10,5 г/дл у здоровых), гематокрита (22,72% против 38,56%) и количества эритроцитов (0,75×10⁶/мм³ против 1,84×10⁶/мм³). Помимо этого, были зафиксированы сниженные значения эритроцитарных индексов — MCV, MCH и MCHC. Данные изменения в совокупности указывают на развитие микроцитарной гипохромной анемии, что является характерным признаком хронических воспалительных процессов и нарушений метаболизма железа.

В то же время общее количество лейкоцитов было значительно повышено у больных рыб (102,49×10³/мм³ против 78,33×10³/мм³ у здоровых), что свидетельствует об активном иммунном ответе на бактериальную инвазию и подтверждает наличие острого воспалительного процесса.

2.3. Биохимические изменения в сыворотке крови

Биохимический профиль больных рыб также претерпел выраженные изменения по сравнению с контрольной группой. Одним из наиболее значимых отклонений явилось повышение уровня глюкозы, что отражает классическую стресс-индуцированную гипергликемию, обусловленную активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и усилением глюконеогенеза под влиянием кортизола.

Концентрация азота мочевины крови была достоверно выше в группе больных рыб, что свидетельствует о нарушении белкового обмена и возможной дисфункции почек. Уровень креатинина, напротив, хотя и был несколько снижен, оставался в пределах колебаний, близких к норме, что может указывать на сохранность клубочковой фильтрации, несмотря на общую стрессовую реакцию.

Показатели липидного обмена — общий холестерин и триглицериды — были существенно снижены у инфицированных особей. Такое снижение, вероятно, связано с нарушением синтетической функции печени и развитием анорексии. Уровень общего белка и глобулинов оказался повышенным у больной рыбы, что интерпретируется как реакция острой фазы, обусловленная активацией гуморального иммунитета и усилением синтеза иммуноглобулинов. При этом альбумин, напротив, снижался, что свидетельствует о недостаточности печёночного синтеза и возможных потерях белка на фоне системного воспаления.

Активность аланинаминотрансферазы была достоверно ниже у больных рыб, что является нестандартным наблюдением, так как обычно повреждение печени сопровождается повышением этого фермента. Однако в данном случае снижение АЛТ может быть следствием глубокого угнетения синтетической функции гепатоцитов или их некроза с истощением ферментных резервов. В то же время активность АСТ не претерпела значимых изменений, а рассчитанное соотношение АСТ/АЛТ было выше у инфицированных особей, что подтверждает наличие выраженного тканевого повреждения, особенно мышечной и печёночной ткани. Активность креатинкиназы также была снижена, что согласуется с картиной общего метаболического истощения.

Электролитный профиль характеризовался значительным снижением уровня кальция и повышением концентрации фосфора. Это указывает на нарушение минерального гомеостаза, что может быть связано как с дисфункцией почек, так и с поражением жаберного эпителия, ответственного за ионный обмен.

2.4. Многомерный статистический анализ

Метод главных компонент продемонстрировал чёткое разделение исследуемых выборок на два кластера, соответствующих группам здоровых и больных рыб. Первая главная компонента объясняла 75,4% общей дисперсии, вторая — 6%, а их совокупный вклад составил 81,4%. Такое высокое разрешение свидетельствует о том, что исследуемые гематологические и биохимические параметры являются мощными классифицирующими признаками и могут эффективно использоваться для дифференциальной диагностики состояния здоровья рыб.

Корреляционный анализ по Спирмену выявил значимые положительные и отрицательные взаимосвязи между параметрами. Так, например, общий белок и глобулин демонстрировали сильную положительную корреляцию, тогда как уровень кальция отрицательно коррелировал с концентрацией мочевины. Эти взаимосвязи подчёркивают комплексность физиологических нарушений и системность патологического процесса при цитробактериозе.

3. Обсуждение

Проведённое исследование является одним из первых, в котором детально охарактеризованы гематологические и биохимические изменения у радужной форели при естественной вспышке цитробактериоза, вызванного совместной циркуляцией Citrobacter gillenii и Citrobacter freundii. Полученные данные позволяют не только расширить существующие представления о патогенезе данного заболевания, но и предложить практические инструменты для раннего выявления и мониторинга инфекционного процесса в условиях аквакультуры.

Выявленное достоверное снижение эритроцитарных показателей — эритроцитов, гемоглобина и гематокрита — свидетельствует о развитии анемии у инфицированной рыбы. В литературе имеются многочисленные подтверждения того, что бактериальные инфекции у рыб нередко сопровождаются анемией, обусловленной гемолизом, угнетением эритропоэза и нарушением утилизации железа. В условиях системного воспаления происходит перераспределение железа, что приводит к снижению его доступности для эритропоэтических процессов. Снижение MCV, MCH и MCHC в настоящем исследовании подтверждает микроцитарно-гипохромный характер анемии, характерный для воспалительных заболеваний.

Противоположная картина наблюдалась со стороны лейкоцитарного звена. Значительный лейкоцитоз указывает на мобилизацию иммунной системы, что соответствует острой фазе бактериальной инфекции. Повышение числа лейкоцитов является защитным механизмом, направленным на элиминацию возбудителя, и ранее описывалось у других видов рыб при инфекциях, вызванных Citrobacter spp.

Биохимические изменения сыворотки крови также имеют чёткое патофизиологическое обоснование. Гипергликемия, зарегистрированная у больных рыб, является классическим проявлением стресс-реакции, опосредованной выбросом кортизола. В условиях инфекционного стресса происходит активация глюконеогенеза и торможение утилизации глюкозы периферическими тканями, что приводит к повышению её уровня в крови. Данный маркер считается высокочувствительным индикатором стресса у рыб и может быть использован для ранней диагностики неблагополучия.

Повышение уровня азота мочевины крови у больных рыб свидетельствует об усиленном катаболизме белков, что наблюдается при тяжелых инфекциях, сопровождающихся лихорадкой, анорексией и мышечной дистрофией. Кроме того, это может быть связано с нарушением выделительной функции почек, что подтверждается также изменениями электролитного профиля — снижением кальция и повышением фосфора, которые являются классическими маркерами почечной дисфункции.

Особого внимания заслуживает снижение активности АЛТ у больных рыб. Традиционно повышение трансаминаз рассматривается как признак поражения гепатоцитов. Однако в данном случае возможны два альтернативных объяснения. Во-первых, длительное течение инфекции может привести к истощению ферментных систем вплоть до угнетения их синтеза на фоне массивного некроза ткани печени. Во-вторых, не исключено, что часть фермента связывается с иммунными комплексами или инактивируется токсинами, выделяемыми бактериями. Повышенное соотношение АСТ/АЛТ при этом подтверждает наличие тканевого повреждения, но, возможно, с преимущественным вовлечением мышечной ткани.

Интересным представляется также повышение уровней общего белка и глобулинов при одновременном снижении альбумина. Такая диспротеинемия характерна для хронических воспалительных процессов, сопровождающихся усилением синтеза белков острой фазы и иммуноглобулинов. Снижение альбумина, помимо печёночной недостаточности, может указывать на увеличение сосудистой проницаемости и потерю белка в экссудат или асцитическую жидкость, что было подтверждено клинически у больных рыб.

Снижение триглицеридов и холестерина также свидетельствует о нарушении липидного обмена, что является следствием общего метаболического сдвига, снижения потребления корма и печёночной дисфункции. Все перечисленные изменения находятся в тесной системной взаимосвязи, что подтверждается данными корреляционного анализа, показавшего значимые связи между основными маркерами воспаления, повреждения ткани и метаболического стресса.

Применение метода главных компонент не только подтвердило статистическую достоверность различий между группами, но и позволило идентифицировать наиболее информативные признаки, вносящие максимальный вклад в разделение выборок. Этот метод может быть рекомендован для создания прогностических моделей риска развития инфекционных осложнений в рыбоводных хозяйствах.

Молекулярная идентификация возбудителей с использованием секвенирования 16S рРНК подтвердила, что основными патогенами в данном случае являются C. freundii и C. gillenii. Эти данные согласуются с немногими имеющимися сообщениями о вспышках цитробактериоза в аквакультуре и подчёркивают необходимость постоянного филогенетического мониторинга циркулирующих штаммов с целью своевременного обновления диагностических панелей и выбора тактики лечения.

Таким образом, комплексный анализ гематологических и биохимических параметров позволяет получить интегральную оценку состояния организма рыбы на всех уровнях: от клеточного до системного. Использование такого подхода в качестве рутинного скринингового метода может значительно повысить эффективность раннего выявления заболеваний, снизить экономические потери и улучшить благополучие культивируемых гидробионтов.

4. Заключение

Проведённое исследование убедительно демонстрирует, что цитробактериоз, вызываемый Citrobacter gillenii и Citrobacter freundii, оказывает глубокое воздействие на гематологический и биохимический гомеостаз радужной форели. Основные выявленные изменения — анемия, лейкоцитоз, гипергликемия, повышение уровня мочевины, диспротеинемия, нарушения липидного и электролитного обмена — отражают ключевые патогенетические механизмы, включающие воспаление, дисфункцию печени и почек, а также системный метаболический стресс.

Интеграция рутинных гематологических методов с биохимическим и молекулярно-генетическим анализом (ПЦР) представляет собой эффективную и экономически оправданную стратегию мониторинга здоровья рыб. Такой подход позволяет не только диагностировать заболевание на ранних стадиях, но и дифференцировать этиологию, оценивать тяжесть состояния и прогнозировать исход инфекции.

Полученные результаты имеют не только фундаментальное значение для понимания патогенеза цитробактериоза, но и обладают выраженной практической ценностью. Они могут быть использованы для разработки стандартов биомониторинга, формирования систем раннего предупреждения эпизоотий и совершенствования программ управления здоровьем в промышленной аквакультуре.

В условиях продолжающегося роста производства радужной форели и повышения антропогенной нагрузки на водные экосистемы, дальнейшие исследования в области гематологической и биохимической диагностики представляются чрезвычайно актуальными. Перспективными направлениями являются углублённое изучение иммунных механизмов, исследование роли окислительного стресса и цитокиновых ответов, а также разработка комплексных оценочных шкал для интегральной оценки физиологического состояния рыбы. Только такой мультидисциплинарный подход способен обеспечить устойчивое развитие аквакультуры в условиях глобальных экологических и эпидемиологических вызовов.

Источник: Aquaculture report