От поражения к выздоровлению: микробная динамика кожи радужной форели при синдроме красных отметин

Синдром красных отметин (СКР) представляет собой инфекционное заболевание кожи товарной радужной форели, наносящее значительный экономический ущерб аквакультуре из-за ухудшения товарного вида рыбы. Несмотря на многолетние исследования, этиологический агент СКР долгое время оставался неидентифицированным, главным образом из-за невозможности культивирования предполагаемого патогена. В настоящей работе мы исследуем временную динамику бактериальных сообществ кожи и воды в ходе экспериментального заражения здоровой радужной форели путём совместного содержания с рыбами, поражёнными СКР. Используя количественную ПЦР для таргетного обнаружения Midichloria-подобного организма (MLO) и секвенирование ампликонов гена 16S рРНК для анализа всего микробного сообщества, мы проследили изменения в микробиоме от доклинической стадии до полного выздоровления. Результаты показывают, что MLO является единственным таксоном, статистически значимо преобладающим в активных очагах поражения на пике заболевания, при этом его количество в коже и воде коррелирует с прогрессированием патологии. На стадии заживления микробиом кожи возвращается к состоянию, близкому к контрольному. Кроме того, на внешне здоровых участках кожи инфицированных рыб наблюдалось увеличение относительной численности условно-патогенных таксонов, таких как Candidatus Branchiomonas и неклассифицированных гаммапротеобактерий, что указывает на вторичный дисбактериоз. Обнаружение MLO в образцах экзогенной ДНК (eDNA) воды в динамике позволяет по-новому взглянуть на пути передачи инфекции. Наши данные подтверждают ключевую роль MLO в патогенезе СКР и указывают на возможность развития смешанных инфекций на фоне заболевания.

Введение

Синдром красных отметин (СКР), также известный как «клубничная болезнь», является широко распространённым заболеванием кожи радужной форели (Oncorhynchus mykiss), встречающимся в пресноводных хозяйствах по всему миру, от Северной Америки и Европы до Чили и Южной Кореи. Заболевание характеризуется появлением множественных ярко-красных приподнятых воспалительных поражений на коже, преимущественно у рыбы товарного размера. Хотя СКР редко приводит к прямой гибели рыбы, оно значительно ухудшает её внешний вид, что влечёт за собой серьёзные экономические потери для производителей из-за снижения качества продукции. В некоторых случаях сообщалось о смертности до 10–60% от общей популяции, однако эти данные требуют подтверждения, поскольку заболевание не входит в список обязательных для отчётности.

Долгое время этиология СКР оставалась предметом дискуссий. Предполагалась инфекционная природа, однако все попытки выделить и культивировать возбудителя из поражённых тканей традиционными методами, включая постулаты Коха, оказывались безуспешными. Первые независимые от культивирования исследования, основанные на анализе гена 16S рРНК, позволили связать СКР с присутствием риккетсиеподобного организма (RLO), который впоследствии был идентифицирован как представитель семейства Candidatus Midichloriaceae и назван Midichloria-подобным организмом (MLO). Последующие молекулярные исследования неоднократно подтверждали корреляцию между наличием MLO и активными поражениями кожи. Кроме того, в пользу бактериальной природы возбудителя свидетельствовала эффективность антибиотикотерапии, а также обнаружение внутриклеточных грамотрицательных микроорганизмов в тканях поражённой рыбы при трансмиссионной электронной микроскопии.

Несмотря на накопленные доказательства, причинно-следственная связь между MLO и СКР долгое время оставалась недоказанной. Критическим недостатком большинства предыдущих работ был их описательный или одномоментный характер. Исследования, как правило, ограничивались сравнением микробиома активных очагов поражения и здоровой кожи, но не учитывали временной аспект — развитие и разрешение заболевания. Для установления причинности в рамках молекулярных постулатов необходимо показать не только наличие предполагаемого патогена в поражённых тканях, но и его количественную динамику, соответствующую течению болезни. Кроме того, оставался открытым вопрос о роли других бактерий, которые могли быть соучастниками инфекционного процесса или условно-патогенными агентами, способствующими дисбактериозу. Также практически не была изучена передача MLO через водную среду.

В настоящем исследовании мы восполнили эти пробелы, проведя детальный временной анализ микробиома кожи и воды в ходе экспериментальной инфекционной модели СКР. Наша цель заключалась в том, чтобы: (1) проследить изменения в составе микробиоты кожи от начальной стадии до полного выздоровления рыб; (2) подтвердить, что относительная численность MLO коррелирует с фазами заболевания и снижается по мере заживления; (3) оценить, являются ли другие таксоны бактерий сопутствующими или вторичными агентами; (4) охарактеризовать присутствие MLO в воде и общую динамику водного микробиома, чтобы получить новые данные о возможных путях передачи возбудителя. Мы использовали комплексный подход, включающий количественную ПЦР для высокочувствительного таргетного анализа MLO и метабаркодинг гена 16S рРНК для характеристики всего бактериального сообщества.

Материалы и методы

Экспериментальная модель и содержание рыб. Исследование проводилось в соответствии с европейскими нормами по этике обращения с животными. Здоровую радужную форель (свободную от специфических патогенов, SPF) средней массой около 140 г перевели в две цилиндрические проточные системы объёмом 180 л: контрольный аквариум (n=50) и аквариум для совместного содержания (n=40). На следующий день (0-й день после совместного содержания, dpc) в аквариум к наивной рыбе добавили семь рыб-«доноров» с подтверждёнными клиническими признаками СКР. Рыб-доноров получали из предыдущих раундов совместного содержания. Условия содержания были стандартными: температура воды 12±1°C, водообмен 35 л/час, насыщение кислородом >90%, автоматическое кормление.

Оценка патологии и отбор проб. Рыб анестезировали бензокаином, взвешивали и проводили макроскопический осмотр в ключевые временные точки: 0, 35, 50, 75, 95 и 112 dpc. Для оценки тяжести заболевания использовали балльную систему, классифицирующую поражения как «отсутствующие», «лёгкие», «умеренные», «тяжёлые» и «заживающие». Для гистологического подтверждения диагноза на 75 dpc были взяты образцы кожи из очагов поражения и контрольные образцы, которые фиксировали в формалине, заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином. В тех же временных точках у пяти случайно выбранных рыб из каждой группы отбирали образцы кожи (квадрат 15×15 мм) для бактериологического анализа. У рыб-сожителей с поражениями брали два образца: непосредственно из очага (L) и с внешне здорового участка (NL). Образцы замораживали на сухом льду. Параллельно из каждого аквариума отбирали пробы воды (по 500 мл), которые фильтровали через 0,22-мкм мембраны и также замораживали для выделения ДНК.

Диагностика и количественная ПЦР MLO. Выделение тотальной нуклеиновой кислоты проводили с использованием автоматизированной системы. Для количественного определения MLO в коже и воде применяли ранее описанную систему праймеров для гена 16S рРНК в формате SYBR Green qPCR. Для построения стандартной кривой использовали синтетический контроль (g-Block). Результаты нормализовали по количеству внесённой ДНК (для кожи) или объёму профильтрованной воды (для воды) и выражали в копиях гена на нг ДНК или на мл воды.

Секвенирование ампликонов 16S рРНК и биоинформатический анализ. Для метабаркодинга использовали универсальные праймеры к гипервариабельному региону V4 гена 16S рРНК. Библиотеки готовили и секвенировали на платформе Illumina NovaSeq 6000 с получением парноконцевых прочтений длиной 250 п.н. Обработку данных проводили в среде R с использованием пакетов DADA2 для фильтрации, объединения прочтений и выявления вариантов последовательностей ампликонов (ASV). Таксономическую классификацию осуществляли по базе SILVA. Из набора данных исключали митохондриальные и хлоропластные последовательности. Для образцов кожи и воды применяли разрежение до равномерной глубины. Бета-разнообразие оценивали с помощью анализа главных компонент на основе устойчивого расстояния Эйтчисона. Дифференциальную представленность таксонов определяли с помощью ALDEx2 с учётом дня совместного содержания как ковариаты. Визуализацию и статистический анализ выполняли в R.

Результаты

Развитие СКР у наивных особей и наблюдаемая смертность. В ходе эксперимента все рыбы в аквариуме совместного содержания успешно развили клиническую картину СКР. Первые лёгкие поражения на коже стали заметны на 50 dpc. Пик заболевания пришёлся на интервал между 50 и 75 dpc, после чего поражения начали заживать. К 112 dpc у всех сожителей наблюдались признаки заживления или полного выздоровления. Гистологический анализ подтвердил характерные для СКР изменения: интенсивную клеточную инфильтрацию всех слоёв кожи, резорбцию чешуи и отёк. Важно отметить, что в группе сожителей была зафиксирована значительно более высокая смертность по сравнению с контрольной группой (32,5% против 8,0%), причём гибель рыб происходила в основном в период с 22 по 49 dpc. Диагностические исследования показали, что у погибших рыб в жабрах и почках часто обнаруживалась бактерия Candidatus Branchiomonas cysticola, а в некоторых случаях — MLO. Посевы внутренних органов не выявили роста других патогенных бактерий.

Количественная динамика MLO в коже и воде. Таргетная qPCR показала, что MLO полностью отсутствовал в коже контрольных рыб. У сожителей MLO детектировался с 35 dpc, причём его количество было наибольшим в очагах поражения на пике заболевания (50 dpc) и значительно снижалось по мере заживления ран. На 112 dpc MLO уже не обнаруживался. На внешне здоровых участках кожи инфицированных рыб MLO также присутствовал, но в значительно меньших количествах. В воде динамика MLO имела два выраженных пика: первый на 20 dpc и второй, более интенсивный, на 75 dpc. Первый пик, вероятно, был связан с выделением MLO от рыб-доноров, у которых на тот момент были активные поражения. Второй пик совпал с периодом активного выделения чешуи и тканевого детрита от вновь заражённых сожителей, у которых к тому времени также начались процессы заживления. В контрольной воде MLO не обнаруживался.

Состав и динамика водного микробиома. Анализ 16S рРНК показал, что в начале эксперимента микробный состав воды в обеих системах был сходным и доминировали представители родов Flavobacterium и неклассифицированные Comamonadaceae. С течением времени в обеих системах наблюдалось увеличение сложности сообщества с возрастанием доли Flectobacillus, Sphaerotilus, Arcicella и других. Основным фактором, определяющим вариабельность микробного состава воды, было время. Эффект резервуара (наличие или отсутствие заболевания) становился заметным, начиная с 35 dpc. Примечательно, что при секвенировании ампликонов 16S рРНК ASV, соответствующий MLO, не был обнаружен ни в одном из образцов воды из-за его крайне низкой относительной численности на фоне доминирующих таксонов.

Изменения микробиома кожи и выявление ключевых таксонов. Микробиом кожи контрольных рыб на начальном этапе был представлен родами Stenotrophomonas, Chryseobacterium и Delftia. С течением времени его сложность увеличивалась, и к концу эксперимента доминирующими становились Collimonas и Delftia как у контроля, так и у сожителей. Однако на пике заболевания (50 dpc) в микробиоме кожи сожителей произошли резкие изменения. В активных очагах поражения подавляющую долю (до 100% в некоторых образцах) составлял один ASV, классифицированный как Candidatus Midichloria, со 100% идентичностью с известной последовательностью MLO. Во внешне здоровых участках кожи тех же рыб значительно возрастала относительная численность двух других ASV: неклассифицированной гаммапротеобактерии и Candidatus Branchiomonas. Эти же таксоны присутствовали в малых количествах и у контрольных рыб, но их распространение было незначительным. Альфа-разнообразие (индексы Шеннона и Пилу) снижалось в коже сожителей в период пика инфекции по сравнению с контролем.

Анализ бета-разнообразия выявил три основных кластера образцов. Основной кластер включал большинство контрольных образцов и образцы от сожителей вне пика заболевания. Второй кластер был представлен образцами от контрольных рыб на ранних стадиях эксперимента. Третий, отдельный, кластер формировали образцы активных поражений и некоторые образцы внешне здоровой кожи сожителей на 50 dpc. Именно этот кластер характеризовался высокими относительными количествами ASV MLO, неклассифицированной гаммапротеобактерии и Ca. Branchiomonas. Статистический анализ дифференциальной представленности (ALDEx2) показал, что только ASV MLO был значимо (p<0,001) обогащён в активных очагах поражения по сравнению с контрольной кожей. Ни один другой таксон не показал статистически значимого увеличения ни в одном из типов образцов (активные поражения, заживающие поражения, неповреждённые участки). Однако относительная численность неклассифицированной гаммапротеобактерии положительно и значимо коррелировала с относительной численностью MLO в одних и тех же рыбах (коэффициент корреляции Пирсона R=0,850), в то время как корреляция с Ca. Branchiomonas была незначимой.

Обсуждение

Наше исследование представляет собой наиболее полный на сегодняшний день временной анализ микробиома кожи и воды при синдроме красных отметин. Главный вывод работы заключается в том, что Midichloria-подобный организм (MLO) является основным этиологическим агентом СКР. В отличие от предыдущих работ, которые были одномоментными, мы показали, что обогащение MLO происходит специфически в активных очагах поражения на пике заболевания, а его количество снижается по мере заживления. Это соответствует ключевым критериям молекулярных постулатов Коха и теории Хилла, устанавливающей связь между микроорганизмом и заболеванием: сила ассоциации, консистентность, специфичность, временная зависимость и градиент биологического эффекта.

Наши данные однозначно свидетельствуют о том, что MLO не является простым комменсалом. Он практически отсутствует у здоровых рыб и появляется одновременно с первыми клиническими признаками. Более того, его количественное содержание в коже коррелирует с тяжестью патологии. Исчезновение MLO по мере заживления ран и его необнаружение в коже полностью выздоровевших особей убедительно доказывает его прямую причастность к инициации и поддержанию воспалительного процесса. Интересно, что мы впервые продемонстрировали наличие двух пиков концентрации MLO в воде. Это позволяет предположить, что передача инфекции от доноров к реципиентам происходит через водную среду, вероятно, при выделении инфицированных чешуек или клеток кожи. Период задержки между появлением поражений и вторым пиком MLO в воде указывает на то, что для выделения патогена в окружающую среду необходимо достижение определённой стадии зрелости поражения. Это открытие имеет важное практическое значение для разработки систем раннего мониторинга и контроля распространения СКР в хозяйствах.

Несмотря на доказанную роль MLO как первичного патогена, наше исследование также проливает свет на сложные взаимодействия в микробиоме кожи в ходе заболевания. Мы наблюдали явление дисбактериоза, которое затрагивало не только непосредственно очаги поражения, но и внешне здоровую кожу больных рыб. В этих областях возрастала относительная численность условно-патогенных таксонов — Candidatus Branchiomonas и неклассифицированных гаммапротеобактерий. Хотя их количество не было статистически значимо выше, чем в контроле, из-за высокой внутригрупповой вариабельности, сам факт увеличения их распространённости на фоне активной инфекции MLO указывает на синергичное или оппортунистическое поведение этих бактерий.

Особого внимания заслуживает обнаружение Ca. Branchiomonas в почках и жабрах погибших рыб. В норме эта бактерия считается частью здорового микробиома жабр лососёвых, но в условиях стресса или иммуносупрессии, вызванной первичной инфекцией MLO, она способна проникать в системный кровоток и колонизировать внутренние органы, что может приводить к летальным исходам. Это подтверждается наблюдением, что Ca. Branchiomonas обнаруживалась в почках только тех рыб, у которых в том же органе присутствовал MLO. Таким образом, СКР может служить «входными воротами» для вторичных инфекций, превращаясь в мультифакториальное заболевание с более высокими рисками смертности. Это является важным дополнением к классическому представлению о СКР как о нелетальном косметическом дефекте.

Возвращение микробиома кожи к контрольному состоянию после заживления поражений демонстрирует устойчивость микробного сообщества радужной форели. После разрешения инфекции и удаления первичного патогена таксономический профиль восстанавливается, что свидетельствует о высокой степени гомеостаза в здоровом состоянии. Однако нельзя исключать, что функциональные изменения в метаболизме микробиоты могут сохраняться дольше, чем таксономические, и это представляет интерес для будущих метагеномных исследований.

Косвенным, но важным результатом нашей работы является демонстрация того, что стандартный метабаркодинг гена 16S рРНК не является достаточно чувствительным методом для обнаружения MLO в воде, где его относительная численность подавляется другими, более распространёнными таксонами. Это подчёркивает критическую важность использования таргетных высокочувствительных подходов, таких как qPCR, для эпидемиологического мониторинга патогенов в окружающей среде.

Заключение

Проведённое исследование убедительно подтверждает, что Midichloria-подобный организм является основным патогеном, ответственным за развитие синдрома красных отметин у радужной форели. Впервые представлена полная временная картина количественных изменений MLO в коже и воде, которая коррелирует с прогрессированием, пиком и разрешением заболевания. Мы показали, что только один таксон — MLO — демонстрирует статистически значимое и специфическое обогащение в активных очагах поражения, что удовлетворяет критериям молекулярной причинности. Кроме того, СКР ассоциирован с системным дисбактериозом и потенциальным увеличением вирулентности оппортунистических бактерий, что объясняет наблюдаемую в некоторых случаях повышенную смертность. Обнаружение MLO в водной среде открывает новые перспективы для разработки неинвазивных методов мониторинга распространения инфекции. Полученные данные закладывают основу для дальнейших исследований генома MLO и разработки специфических стратегий профилактики и лечения этого широко распространённого заболевания.

Источник: Animal Microbiome