Влияние введения PACAP на экспрессию цитокинов, вызванную липополисахаридом, в клеточной линии SHK-1 атлантического лосося.

Глобальная аквакультура, достигшая объёма производства в 60,5 млн тонн, сталкивается с серьёзными экономическими потерями из-за инфекционных заболеваний. Широкое применение антибиотиков для борьбы с ними ведёт к рискам развития резистентности и загрязнению окружающей среды. В этой связи поиск эффективных и безопасных альтернатив становится критически важным. Одним из перспективных кандидатов является полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза (PACAP) – многофункциональная сигнальная молекула, демонстрирующая как прямую антимикробную активность, так и иммуномодулирующие свойства.

У млекопитающих PACAP известен преимущественно как противовоспалительный агент, подавляющий секрецию провоспалительных цитокинов. Однако у костистых рыб, включая виды, важные для аквакультуры, данные указывают на иммуностимулирующий эффект PACAP. Это противоречие подчеркивает необходимость изучения специфических механизмов действия PACAP у рыб. Целью данного исследования было выяснить, как PACAP влияет на экспрессию ключевых цитокинов, индуцированную бактериальными патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP), в макрофагоподобных клетках атлантического лосося (линия SHK-1), и определить сигнальные пути, опосредующие этот эффект.

Методы

В работе использовали синтетический пептид PACAP-38 на основе последовательности Clarias gariepinus. В качестве иммуностимуляторов применяли очищенный липополисахарид (ЛПС) и суспензию убитых нагреванием бактерий Flavobacterium columnare. Клетки SHK-1 предварительно обрабатывали PACAP в различных концентрациях (40-1000 нМ) за 24 часа до стимуляции, а в части экспериментов добавляли второй «импульс» пептида одновременно со стимулятором. Для изучения вовлечённых сигнальных путей использовали ингибитор фосфодиэстеразы IBMX (повышающий внутриклеточный уровень цАМФ), ингибитор протеинкиназы С сафингол (влияющий на фосфолипазу C), а также специфические ингибиторы рецепторов PACAP: PG97-269 (VPAC1) и max.d.4 (PAC1). Уровни мРНК цитокинов (il-1β, tnf-α, il-10) и рецепторов PACAP (vpac1, pac1) оценивали методом количественной ПЦР в реальном времени с нормализацией к гену ef-1α.

Результаты

1. Влияние PACAP на LPS-индуцированную экспрессию цитокинов. Обработка клеток PACAP (1000 нМ) за 24 часа до стимуляции ЛПС статистически значимо усиливала экспрессию гена провоспалительного цитокина il-1β, но не влияла на экспрессию tnf-α. Введение второго «импульса» PACAP усиливало эффект: значимое повышение уровня il-1β наблюдалось уже при концентрациях 40 и 600 нМ.

2. Ответ на цельные бактериальные PAMP. При стимуляции клеток убитыми F. columnare эффект PACAP проявлялся иначе. При высокой бактериальной нагрузке PACAP не изменял экспрессию цитокинов. Однако при низкой нагрузке обработка PACAP (200 нМ) усиливала экспрессию как il-1β, так и tnf-α (при 1000 нМ). Это указывает на то, что иммуномодулирующий эффект PACAP зависит от контекста и силы иммунного стимула.

3. Роль цАМФ-опосредованной сигнализации. Ингибитор фосфодиэстеразы IBMX, в отличие от PACAP, не усиливал, а даже снижал LPS-индуцированную экспрессию il-1β. Кроме того, IBMX подавлял индуцируемую ЛПС экспрессию противовоспалительного цитокина il-10 и существенно повышал уровень экспрессии рецептора vpac1. Эти данные свидетельствуют, что иммуностимулирующий эффект PACAP у рыб, вероятно, не связан с классическим для млекопитающих механизмом накопления внутриклеточного цАМФ.

4. Вовлечённость пути фосфолипазы C/протеинкиназы C. Ингибирование PKC сафинголом приводило к эффекту, сходному с действием PACAP: значительному усилению LPS-индуцированной экспрессии il-1β. Однако, в отличие от PACAP, сафингол также вызывал повышение уровня il-10. Сочетанное применение PACAP и сафингола не давало аддитивного эффекта, что позволяет предположить возможное пересечение или общность их действия на данном пути.

5. Значение специфических рецепторов PACAP. Блокирование рецептора VPAC1 ингибитором PG97-269 в отсутствие экзогенного PACAP приводило к увеличению LPS-индуцированной экспрессии il-1β и появлению экспрессии il-10. Это указывает на то, что тоническая сигнализация через рецептор VPAC1 может оказывать сдерживающее влияние на воспалительный ответ. Ингибирование рецептора PAC1 (max.d.4) такого эффекта не вызывало.

Обсуждение

Полученные результаты подтверждают иммуностимулирующий потенциал PACAP в отношении врождённого иммунитета костистых рыб, проявляющийся в усилении экспрессии ключевого провоспалительного цитокина IL-1β в ответ на бактериальные PAMP. Однако выявленные механизмы существенно отличаются от известных для млекопитающих.

Ключевой вывод исследования заключается в том, что классический противовоспалительный сигнальный путь, опосредованный цАМФ, по-видимому, не является основным в реализации иммуностимулирующего действия PACAP у лосося. На это указывает противоположный характер влияния IBMX и PACAP на экспрессию il-1β.

Напротив, данные указывают на возможную важность сигнального пути, связанного с фосфолипазой C и протеинкиназой C. Сходство эффектов PACAP и ингибитора PKC сафингола позволяет предположить, что PACAP может модулировать воспалительный ответ, воздействуя на этот путь. Кроме того, эксперименты с ингибиторами рецепторов позволяют выдвинуть гипотезу о предпочтительной активации рецептора PAC1 как о возможном механизме. В условиях, когда сигналинг через VPAC1 заблокирован (ингибитором PG97-269) или когда PACAP избирательно активирует PAC1 (из-за более высокого сродства), это может смещать баланс в сторону активации специфических внутриклеточных путей (например, PLC/PKC или PI3K/Akt), ведущих к усилению экспрессии провоспалительных медиаторов.

Заключение и перспективы

Исследование углубляет понимание иммуномодулирующих свойств PACAP у рыб, выявляя фундаментальные различия в его действии по сравнению с млекопитающими. Полученные данные свидетельствуют, что иммуностимулирующий эффект у лосося, вероятно, опосредован не цАМФ-зависимым, а альтернативными путями, потенциально связанными с активацией рецептора PAC1 и последующей модуляцией сигналинга через фосфолипазу C.

Дальнейшие исследования должны быть направлены на прямое подтверждение этой гипотезы: изучение уровня вторичных мессенджеров (инозитолтрифосфат, диацилглицерин), фосфорилирования белков-мишеней PKC и Akt, а также анализ последствий избирательного нокдауна или сверхэкспрессии рецепторов PAC1 и VPAC1.

Понимание точных механизмов действия PACAP имеет не только фундаментальное, но и важное прикладное значение. Оно необходимо для рационального дизайна и оптимизации PACAP-содержащих препаратов в качестве безопасной и эффективной альтернативы антибиотикам в аквакультуре, способствующей минимизации экономических потерь от болезней без ущерба для окружающей среды.

Исследование: Fish and Shellfish Immunology